PCR, qPCR, dPCR e ddPCR
TL;DR
PCR amplifica uma região-alvo de DNA. qPCR mede a amplificação em tempo real e costuma ser usada para abundância relativa. dPCR/ddPCR particiona a amostra em muitas reações e estima número absoluto de cópias contando partições positivas. Esses métodos são rápidos e sensíveis, mas só respondem perguntas sobre alvos para os quais primers/probes foram desenhados. Fontes: [1], [2]
O que mede
| Método | Mede | Uso típico em oncologia |
|---|---|---|
| PCR | presença/tamanho de amplicon | clonabilidade, verificação de construto |
| RT-PCR | RNA convertido em cDNA | detecção de fusão ou transcrito viral |
| qPCR | abundância relativa ou calibrada | expressão gênica, estimativa de número de cópias |
| dPCR / ddPCR | cópias absolutas ou fração alélica | mutação de baixa frequência, monitoramento tipo DMR, CNV |
O que não mede
- mutações desconhecidas fora do ensaio desenhado
- contexto genômico amplo
- isoformas, salvo desenho específico
- abundância de proteína
- identidade celular
- localização tecidual
Se você ainda não sabe qual alvo perguntar, sequenciamento geralmente é a melhor primeira ferramenta.
Perguntas de QC
- As sequências de primer/probe estão documentadas?
- O amplicon é específico?
- Controles sem template e sem RT estão limpos?
- A integridade do RNA é aceitável para RT-qPCR?
- Genes de referência são estáveis neste tipo de amostra?
- A eficiência de amplificação foi medida?
- Em dPCR, partições são numerosas e limiar/rain foram tratados de forma consistente?
Saída computacional
| Saída bruta | Interpretação |
|---|---|
| Ct/Cq | valor menor geralmente significa mais template inicial |
| curva de melting | checagem de especificidade |
| contagem de gotículas/partições | cópias absolutas após correção de Poisson |
| curva padrão | quantificação e eficiência |
Notas para desenvolvedores
- Guarde IDs de primers/probes como metadados estruturados, não texto solto.
- Preserve Ct/Cq bruto; não armazene só fold change normalizado.
- Registre poços falhos e réplicas excluídas explicitamente.
- Documente genes de referência e método de normalização.
- Em ddPCR, preserve regras de limiar e contagens de gotículas, não só a concentração final.
- Não compare corridas de qPCR sem contexto de batch, placa e eficiência.
Referências
- Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem 2009;55:611-622. PMID 19246619. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797
- Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. MIQE 2.0: Revision of the Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments Guidelines. Clin Chem 2025. PMID 40272429. https://doi.org/10.1093/clinchem/hvaf043