Preparo de amostras e controle de qualidade
Nota: esta página é educacional. Trabalho de laboratório real exige SOPs, biossegurança, aprovações institucionais e supervisão treinada.
TL;DR
Preparo de amostra é a primeira etapa da análise. Antes de PCR, sequenciamento, proteômica, citometria ou imagem, o material biológico já foi filtrado por coleta, tempo de isquemia, fixação, armazenamento, extração, dissociação e QC. Muitas "surpresas computacionais" são artefatos de preparo.
1. O que pode acontecer com uma amostra tumoral
| Estado da amostra | Uso comum | Risco principal |
|---|---|---|
| Tecido fresco | organoides, flow, single-cell, ensaios viáveis | isquemia, viés de dissociação |
| Fresh frozen | DNA/RNA/proteína, espacial, metabolômica | falha de cadeia fria, freeze-thaw |
| FFPE | patologia, IHC, FISH, DNA/RNA alvo | fragmentação, artefatos de formol |
| Plasma | ctDNA, proteínas, metabólitos | hemólise, processamento atrasado |
| Células sanguíneas | DNA germinativo, perfil imune | anticoagulante e armazenamento |
| Medula óssea | flow/NGS hematológico | hemodiluição, coagulação |
| Derrame/ascite | citologia, organoides, cfDNA | baixa fração tumoral, inflamação |
2. Variáveis pré-analíticas
O mesmo tumor pode produzir dados diferentes dependendo de:
- tempo da excisão até preservação
- temperatura no transporte
- tipo de fixador e duração de fixação
- celularidade tumoral e necrose
- mistura de estroma e células imunes
- contaminação por sangue
- método de extração
- ciclos freeze-thaw
- ordem de batch
- diferenças de operador e instrumento
Quando os dados parecem estranhos, cheque a cadeia de custódia antes de culpar a biologia.
3. QC por família de ensaio
| Família | Sinais de QC |
|---|---|
| Sequenciamento de DNA | quantidade de DNA, tamanho de fragmento, pureza tumoral, yield de biblioteca, profundidade |
| RNA-seq / RT-qPCR | integridade de RNA, DV200/RIN, conteúdo ribossomal, taxa de mapeamento |
| Proteômica | yield de proteína, eficiência de digestão, IDs de peptídeos, missingness |
| Flow/FACS | viabilidade, singlets, compensação, controles unstained/FMO |
| IHC/IF/FISH | preservação tecidual, controles, batch de coloração, QC do scanner |
| Organoides/screens | viabilidade, micoplasma, número de passagem, taxa de crescimento |
4. Pureza tumoral importa
Uma amostra tumoral bulk é uma mistura:
- células malignas
- fibroblastos
- células imunes
- células endoteliais
- necrose
- tecido normal adjacente
- sangue
Baixa pureza tumoral pode esconder mutações, diluir expressão de RNA, borrar metilação e confundir proteômica. Alta infiltração imune pode ser biologia real ou confundidor, dependendo da pergunta.
5. Metadados que desenvolvedores deveriam exigir
Para toda amostra, tente capturar:
| Metadado | Por que importa |
|---|---|
| tipo de amostra e sítio anatômico | comparabilidade biológica |
| horário de coleta e preservação | degradação e isquemia |
| método de preservação | FFPE vs frozen vs fresco |
| porcentagem tumoral | detecção de variantes e interpretação de expressão |
| porcentagem de necrose | falha de extração e artefatos |
| terapia prévia | mudanças induzidas por tratamento |
| kit/protocolo de extração | batch effects |
| métricas de QC | reprodutibilidade e filtros |
| batch e operador | confundimento oculto |
6. O que tecnologistas podem construir
- Grafos de linhagem da amostra da coleta ao arquivo.
- Dashboards de QC combinando métricas de bancada e computacionais.
- Relatórios de batch effect antes da interpretação biológica.
- Validadores de metadados que bloqueiam análise quando campos essenciais faltam.
- Pipelines sensíveis à pureza tumoral para mutação, expressão e metilação.