Transcriptômica 101 (Câncer)

Em revisão científica

Esta página introdutória serve para orientação educacional. Não use este conteúdo para interpretar um paciente ou tomar decisão clínica.

A Transcriptômica mede a abundância de RNA e o uso de isoformas. Em tumores, revela a atividade de vias, infiltração imune e assinaturas de resposta a medicamentos.

O Problema dos Dados (A Matriz de Contagens)

A unidade fundamental da transcriptômica computacional é a Matriz de Contagens (Count Matrix). Após sequenciar o RNA e alinhar as leituras (reads) ao genoma, criamos uma tabela onde as linhas são genes (ex: ~20.000 genes humanos) e as colunas são amostras de pacientes. O número na célula é quantas vezes um "read" caiu naquele gene.

O desafio de normalização: Você não pode simplesmente comparar matrizes cruas.

• Se a Amostra A teve 10 milhões de leituras totais e a Amostra B teve 20 milhões, todos os genes na Amostra B parecerão mais "expressos" (viés de profundidade de sequenciamento).
• Se o Gene X tem 10.000 letras (pares de base) de comprimento e o Gene Y tem 1.000, o Gene X capturará 10 vezes mais leituras naturalmente (viés de comprimento do gene).

Unidades de Normalização

Tecnólogos encontrarão três unidades principais em bases de dados públicas (como o TCGA):

• Raw Counts: Usado estritamente como input para softwares de análise diferencial (ex: DESeq2).
• FPKM / RPKM (Reads Per Kilobase Million): Normaliza pelo tamanho do gene e pela profundidade da biblioteca. É uma métrica legado.
• TPM (Transcripts Per Million): unidade comum para abundância relativa. Por construção, os TPMs de uma amostra somam aproximadamente 1.000.000. Isso não remove automaticamente composição da biblioteca, batch ou outros vieses entre amostras; a unidade e o método devem combinar com a pergunta.

Análise de Expressão Diferencial (DEA)

A pergunta clínica clássica: "Quais genes estão com expressão alterada entre Tumores que responderam à droga vs Tumores resistentes?"

Isto é um problema estatístico de alta dimensionalidade: milhares de genes são testados simultaneamente, e o número de réplicas biológicas costuma ser muito menor. Ferramentas em R/Bioconductor como DESeq2 e edgeR usam modelos para dados de contagem, incluindo a distribuição binomial negativa e estimação moderada de dispersão. O desenho experimental, a replicação e a matriz de contrastes continuam determinantes; nenhuma ferramenta compensa um estudo sem replicação adequada.

• Log2 Fold Change (Log2FC): A magnitude da mudança. Um log2FC de 2 significa que o gene expressou 4 vezes mais no tumor.
• FDR / p-adj (False Discovery Rate; taxa de falsas descobertas): medida ajustada para controlar o erro esperado associado a muitos testes simultâneos, frequentemente pelo procedimento de Benjamini-Hochberg.

Fontes: [1], [2], [3].

Enriquecimento de conjuntos gênicos (GSEA)

GSEA não é uma técnica de redução de dimensionalidade. É um método de enriquecimento que testa se genes de conjuntos predefinidos tendem a aparecer no topo ou no fim de uma lista ranqueada.

O método pode comparar um ranking derivado de um contraste com coleções como Hallmark ou Reactome. O resultado depende do ranking, da coleção e versão dos conjuntos, do universo analisado, da estratégia de permutação e do controle de múltiplos testes. “Via enriquecida” não prova ativação causal, e GSEA clássico não deve ser confundido com métodos por amostra, como ssGSEA.

Fontes: [4], [5].

Célula única e espacial

Para heterogeneidade e microanatomia, veja Introdução a célula única e espacial.

Ângulos Clínicos

• Transcritomas de fusão (alguns ensaios são baseados em DNA; outros são baseados primariamente em RNA)
• Repertório imune e padrões de expressão relacionados a checkpoints
• Diagnósticos complementares (Companion diagnostics) às vezes usam expressão (veja Biomarcadores)

Veja também

• Genômica 101 · Proteômica 101
• Hub de ômicas · Integração multiômica

Referências

1. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 2014;15:550. PMID 25516281. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25516281/
2. Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 2010;26:139–140. PMID 19910308. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19910308/
3. Schurch NJ, et al. How many biological replicates are needed in an RNA-seq experiment and which differential expression tool should you use? RNA. 2016;22:839–851. PMID 27022035. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27022035/
4. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. PNAS. 2005;102:15545–15550. PMID 16199517. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16199517/
5. Candia J, Ferrucci L. Assessment of Gene Set Enrichment Analysis using curated RNA-seq-based benchmarks. PLOS ONE. 2024;19:e0302696. PMID 38753612. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38753612/