Transcriptômica 101 (Câncer)
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A Transcriptômica mede a abundância de RNA e o uso de isoformas. Em tumores, revela a atividade de vias, infiltração imune e assinaturas de resposta a medicamentos.
O Problema dos Dados (A Matriz de Contagens)
A unidade fundamental da transcriptômica computacional é a Matriz de Contagens (Count Matrix). Após sequenciar o RNA e alinhar as leituras (reads) ao genoma, criamos uma tabela onde as linhas são genes (ex: ~20.000 genes humanos) e as colunas são amostras de pacientes. O número na célula é quantas vezes um "read" caiu naquele gene.
O desafio de normalização: Você não pode simplesmente comparar matrizes cruas.
- Se a Amostra A teve 10 milhões de leituras totais e a Amostra B teve 20 milhões, todos os genes na Amostra B parecerão mais "expressos" (viés de profundidade de sequenciamento).
- Se o Gene X tem 10.000 letras (pares de base) de comprimento e o Gene Y tem 1.000, o Gene X capturará 10 vezes mais leituras naturalmente (viés de comprimento do gene).
Unidades de Normalização
Tecnólogos encontrarão três unidades principais em bases de dados públicas (como o TCGA):
- Raw Counts: Usado estritamente como input para softwares de análise diferencial (ex: DESeq2).
- FPKM / RPKM (Reads Per Kilobase Million): Normaliza pelo tamanho do gene e pela profundidade da biblioteca. É uma métrica legado.
- TPM (Transcripts Per Million): O padrão moderno. Se você somar todos os valores TPM de uma amostra, o resultado é sempre 1.000.000. Facilita muito a comparação da proporção de um gene entre amostras diferentes.
Análise de Expressão Diferencial (DEA)
A pergunta clínica clássica: "Quais genes estão com expressão alterada entre Tumores que responderam à droga vs Tumores resistentes?"
Isto é um problema estatístico massivo: testar 20.000 genes simultaneamente em apenas 50 ou 100 amostras (a "Maldição da Dimensionalidade"). Softwares padrão da indústria, escritos primariamente em linguagem R, como DESeq2 e edgeR, modelam os dados usando uma distribuição Binomial Negativa para lidar com a variância extrema comum em dados de biologia. Eles geram como output:
- Log2 Fold Change (Log2FC): A magnitude da mudança. Um log2FC de 2 significa que o gene expressou 4 vezes mais no tumor.
- FDR / p-adj (Falso Discovery Rate): Um valor-p rigorosamente ajustado (geralmente pelo método Benjamini-Hochberg) para punir falsos positivos gerados por fazer 20.000 testes estatísticos de uma vez.
Redução de Dimensionalidade (GSEA)
Em vez de focar em uma lista de 500 genes individuais alterados (o que é confuso biologicamente), os cientistas de dados usam GSEA (Gene Set Enrichment Analysis).
O GSEA compara seus resultados com bancos de dados de "Vias Biológicas" (como KEGG ou Hallmark Pathways). Em vez de dizer "Gene A, B e C estão altos", o GSEA conclui matematicamente: "A via inteira de Glicólise (Efeito Warburg) está enriquecida nesta amostra".
Célula única e espacial
Para heterogeneidade e microanatomia, veja Introdução a célula única e espacial.
Ângulos Clínicos
- Transcritomas de fusão (alguns ensaios são baseados em DNA; outros são baseados primariamente em RNA)
- Repertório imune e padrões de expressão relacionados a checkpoints
- Diagnósticos complementares (Companion diagnostics) às vezes usam expressão (veja Biomarcadores)