Detecção de proteínas: Western, ELISA e espectrometria de massa
Em revisão científica
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TL;DR
Ensaios de proteína fazem uma pergunta diferente de DNA/RNA: a proteína está presente, modificada, secretada, ligada ou alterada em abundância? Western blot é visual e alvo-específico. ELISA é alvo-específico e quantitativo em fluidos ou lisados. Espectrometria de massa pode identificar e quantificar muitas proteínas ou peptídeos de uma vez, mas exige preparo cuidadoso e análise computacional. Fontes: [1], [2]
Comparação
| Método | Força | Fraqueza |
|---|---|---|
| Western blot | tamanho + sinal de anticorpo | semiquantitativo, dependente de anticorpo |
| ELISA | quantificação escalável | um/poucos alvos, efeito de matriz |
| Imunoensaio multiplex | painel de citocinas/proteínas | reatividade cruzada e calibração |
| LC-MS/MS proteômica | descoberta ampla de proteínas/peptídeos | complexidade, missingness, custo |
| MS direcionada | quantificação precisa de peptídeos | desenvolvimento de ensaio |
Exemplos em oncologia
- confirmar ativação de via por fosfoproteína
- medir citocinas secretadas após estímulo imune
- perfilar proteínas em soro ou plasma
- validar especificidade de anticorpo
- detectar biomarcadores proteicos em tumor
- quantificar engajamento ou degradação de alvo farmacológico
O que não resolve
- status mutacional de DNA por si só
- localização espacial sem imagem de tecido
- atribuição por tipo celular em amostras mistas
- causalidade sem perturbação
- biologia confiável se o anticorpo ou ensaio peptídico não foi validado
Saída computacional
| Ensaio | Saída |
|---|---|
| Western | imagem, intensidade de banda, normalização |
| ELISA | curva padrão, concentração |
| Multiplex | matriz de analitos |
| MS shotgun | PSMs, grupos de proteínas |
| MS direcionada | intensidades de transição, abundância absoluta/relativa |
Notas para desenvolvedores
- ID, clone, lote, diluição e contexto de validação do anticorpo são dados.
- Intensidade de banda de Western sem exposição e normalização é frágil.
- Concentrações de ELISA dependem de curva padrão e compatibilidade de matriz.
- Grupos de proteínas em proteômica podem colapsar isoformas ou homólogos.
- Valores ausentes em espectrometria de massa frequentemente são estruturados, não aleatórios.
- Abundância de proteína não implica atividade automaticamente; fosforilação, localização e complexos podem importar.
Referências
- Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Proc Natl Acad Sci U S A 1979;76:4350-4354. PMID 388439. https://doi.org/10.1073/pnas.76.9.4350
- Uhlen M, Bandrowski A, Carr S, et al. A proposal for validation of antibodies. Nat Methods 2016;13:823-827. PMID 27595404. https://doi.org/10.1038/nmeth.3995